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凝固法

(生物物理法)

凝固法是通過檢測血漿在凝血激活劑作用下的一系列物理量 (光、電、機(jī)械運(yùn)動等)的變化，再由計算機(jī)分析所得數(shù)據(jù)并將之換算成最終結(jié)果，所以也可將其稱作生物物理法。

a.電流法

電流法利用纖維蛋白原無導(dǎo)電性而血凝分析儀基本原理纖維蛋白具有導(dǎo)電性的特點(diǎn)，將待測樣品作為電路的一部分，根據(jù)凝血過程中電路電流的變化來判斷纖維蛋白的形成。但由于電流法的不可靠性及單一性，所以很快被更靈敏、更易擴(kuò)展的光學(xué)法所淘汰。

b. 光學(xué)法(比濁法)

光學(xué)法血凝儀是根據(jù)凝固過程中濁度的變化來測定凝血功能。

根據(jù)待驗(yàn)樣品在凝固過程中光的變化來確定檢測終點(diǎn)的。當(dāng)向樣品中加入凝血激活劑后，隨著樣品中纖維蛋白凝塊的形成過程，樣品的光強(qiáng)度逐步增加，儀器把這種光學(xué)變化描繪成凝固曲線，當(dāng)樣品完全凝固以后，光的強(qiáng)度不再變化。通常是把凝固的起始點(diǎn)作為 0%，凝固終點(diǎn)作為100%，把50%作為凝固時間。光探測器接收這一光的變化，將其轉(zhuǎn)化為電信號，經(jīng)過放大再被傳送到監(jiān)測器上進(jìn)行處理，描出凝固曲線。

光學(xué)法凝血測試的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、儀器結(jié)構(gòu)簡單、易于自動化 ; 缺點(diǎn)是樣品的光學(xué)異常、測試杯的光潔度、加樣中的氣泡等都會成為測量的干擾因素。

c.磁珠法

早期的磁珠法是在檢測杯中放入一粒磁珠，與杯外一根鐵磁金屬桿緊貼呈直線狀，標(biāo)本凝固后，由于纖維蛋白的形成，使磁珠移位而偏離金屬桿，儀器據(jù)此檢測出凝固終點(diǎn)，這類儀器也可稱為平面磁珠法。早期平面磁珠法能有效克服光學(xué)法中樣品本底干擾問題，但存在靈敏度低等缺點(diǎn)。

現(xiàn)代磁珠法出現(xiàn)在 20世紀(jì)80年代末，90年代初進(jìn)入商品化?，F(xiàn)代磁珠法被稱為雙磁路磁珠法。雙磁路磁珠法的測試原理如下: 測試杯的兩側(cè)有一組驅(qū)動線圈，它們產(chǎn)生恒定的交變電磁場，使測試杯內(nèi)特制的去磁小鋼珠保持等幅振蕩運(yùn)動。凝血激活劑加入后，隨著纖維蛋白的產(chǎn)生增多，血漿的粘稠度增加，小鋼珠的運(yùn)動振幅逐漸減弱，儀器根據(jù)另一組測量線圈感應(yīng)到小鋼珠運(yùn)動的變化，當(dāng)運(yùn)動幅度衰減到50%時確定凝固終點(diǎn)。

底物顯色法

(生物化學(xué)法)

底物顯色法是通過測定產(chǎn)色底物的吸光度變化來推測所測物質(zhì)的含量和活性的，該方法又可稱為生物化學(xué)法。檢測通道由一個鹵素?zé)魹闄z測光源，波長一般為 405nm。探測器與光源呈直線，與比色計相仿。

血凝儀使用產(chǎn)色底物檢測血栓與止血指標(biāo)的原理是 : 通過人工合成與天然凝血因子有相似的一段氨基酸排列順序、并還有特定作用位點(diǎn)的小肽，并將可水解產(chǎn)色的化學(xué)基因與作用位點(diǎn)的氨基酸相連。測定時由于凝血因子具有蛋白水解酶的活性，它不僅能作用于天然蛋白質(zhì)肽鏈，也能作用于人工合成的肽鏈底物，從而釋放出產(chǎn)色基因，使溶液呈色。產(chǎn)生顏色的深淺與凝血因子活性成比例關(guān)系，故可進(jìn)行精確的定量。人工合成的多肽底物有幾十種，而最常用的是對硝基苯胺(PNA)，呈黃色，可用405mm波長進(jìn)行測定。

免疫學(xué)方法

在免疫學(xué)方法中以純化的被檢物質(zhì)為抗原，制備相應(yīng)的抗體，然后用抗原抗體血凝分析儀基本原理反應(yīng)對被檢物進(jìn)行定性和定量測定。常用方法有 :

a.免疫擴(kuò)散法。將被檢物與相應(yīng)抗體在一定介質(zhì)中結(jié)合，測定其沉淀環(huán)大小，與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，計算待測物濃度。此法操作簡單，不需特殊設(shè)備，但耗時過長，靈敏度不高，僅適于含量較高凝血因子檢測。

b.箭電泳。在一定電場中，凝膠支持物內(nèi)的被檢物與其相應(yīng)抗體結(jié)合形成的一個個“火箭峰”，火箭峰的高度與其含量成正比，通過測定峰高并與標(biāo)準(zhǔn)比較進(jìn)行定量測定。此法操作復(fù)雜，臨床應(yīng)用較少。

c.雙向免疫電泳。 通過水平與垂直兩個方向進(jìn)行電泳可將某些分子結(jié)構(gòu)異常的凝血因子進(jìn)行分離。

d.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)。用酶標(biāo)抗原或抗體和被檢物進(jìn)行抗原結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)過洗滌除去未結(jié)合的抗原或抗體及標(biāo)本中的干擾物質(zhì)，留下固定在管壁的抗原抗體復(fù)合物，然后加入酶的底物和色原性物質(zhì)，反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，顏色深淺與被檢物濃度呈比例關(guān)系。該法靈敏度高，特異強(qiáng)，已用于許多止血、血栓成分檢測。

e.免疫比濁法。 將被檢物與其相應(yīng)抗體混合形成復(fù)合物，從而產(chǎn)生足夠大的沉淀顆粒，通過透射比濁或散射比濁進(jìn)行測定。此法操作簡便，準(zhǔn)確性好，便于自動化。